Die fröhliche Spinne von nebenan zu sein, ist nicht mehr leicht für Peter Parker (Tobey Maguire), der versucht sein Privatleben und seine Heldentaten als Spider-Man unter einen Hut zu bekommen. Er hat einen Nebenjob als Pizzabote, muss an der Universität glänzen und über die Trennung von Mary Jane (Kirsten Dunst) hinwegkommen. Zudem geht seiner Tante May (Rosemary Harris) das Geld aus, sein bester Freund Harry (James Franco) hat den Tod seines Vaters noch nicht verkraftet und gibt Spider-Man die Schuld. Er ahnt nicht, wer hinter der Maske steckt und hilft Peter bei seinem Uniprojekt, indem er ihm zu einem Experiment von Doktor Octavius (Alfred Molina) Zutritt verschafft. Der Wissenschaftler versucht, eine Energiequelle zu entdecken, die an einen Menschen angeschlossen werden kann. Das Experiment gerät jedoch außer Kontrolle und vier mechanische Greifarme verbinden sich mit seinem Körper. Mit Doc Oc ist ein neuer Rivale für Spider-Man geschaffen. Peter würde jedoch nichts lieber tun, als sein Kostüm in den Müll zu werfen und seiner großen Liebe endlich seine Gefühle zu gestehen.